Primärzellen können nur für eine limitierte Anzahl von Passagen in Kultur expandiert werden. Im Verlauf der Kultivierung nimmt die Proliferationsrate ab, bis die Zellen schließlich in die Seneszenz übergehen, welche mit einem unwiderruflichen Wachstumsstop nach ca. 40 bis 70 Populationsverdopplungen einhergeht. Zusätzlich ist die Kultivierung von Zellen mit erheblichen morphologischen Veränderungen, einem Einfluss auf das Wachstumsmuster und dem Verlust des Differezierungspotenzials verbunden. Insbesondere für die Zelltherapie sind qualitativ hochwertige Zellen in früher Passage zu bevorzugen. Daher ist es unerlässlich, das Fortschreiten der replikativen Seneszenz zu analysieren.
Wie kann man replikative Seneszenz nachweisen?
Cygenia bietet einen neuen Assay für die Bestimmung der replikativen Seneszenz an, welcher auf epigenetischen Veränderungen basiert. Gängige Methoden zur Bestimmung der zellulären Alterung sind bislang unpräzise - eine Abgrenzung von Veränderungen, ausgelöst durch die Alterung des Organismus sowie die Bestimmung der Populationsverdopplungen in vitro ist damit nicht möglich. Unsere Methode ist zudem mit frischen und an kryokonservierten Proben anwendbar - die DNA kann sowohl aus Zellpellets, wie auch aus kryokonservierten Zellen in DMSO-haltigem Medium gewonnen werden, ohne dass die Zellen erneut kultiviert werden müssen. Unter Berücksichtigung einer Vielzahl von DNA-Methylierungsprofilen haben wir eine Epigenetische-Seneszenz-Signatur entwickelt, die aus sechs spezifischen genomischen Regionen besteht (sogenannte CpG sites). Anhand dieser Daten ist es möglich, die Anzahl an Passagen und Populationsverdopplungen von Zellen während der Kulturexpansion zu bestimmen - und damit die Qualitätskontrolle von Zellpräparationen zu ergänzen.
Cygenia bietet diesen Service für Wissenschaftler an - insbesondere auch im Rahmen der Herstellung von Produkten für die Zelltherapie, welche besonders hohen Qualitätsstandards unterliegen. Die Epigenetische-Seneszenz-Signatur wurde bislang an humanen Fibroblasten, mesenchymalen Stammzellen und HUVECs validiert. Um die Vorhersagen der Populationsverdopplungszahlen (cPD) so präzise wie möglich treffen zu können, wurden die verschiedensten Kulturmethoden für das Modell getestet. Dieser Assay richtet sich auch an Wissenschaftler, die den Einfluss spezifischer Wachstumsfaktoren, Bestrahlung, Hypoxie etc. auf den epigenetischen Stand der zellulären Alterung analysieren wollen.
Literaturverweise
Franzen J, et al. DNA methylation changes during long-term in vitro cell culture are caused by epigenetic drift. Communications Biology, 2021.
Koch C, et al. Monitoring of cellular aging by DNA-methylation at specific CpG sites. Aging Cell 2012.
Koch C and Wagner W. Epigenetic Biomarker to Determine Replicative Senescence of in vitro-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology 2013.
Patent application: 2011; EP 11176593.9